HPLC и ICP-MS: лабораторные методы для анализа кратома

Кратко

Два референсных метода для анализа кратома в аккредитованных лабораториях - HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) для определения алкалоидов и ICP-MS (масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой) для определения тяжёлых металлов. Оба метода описаны в USP и в стандартах ISO как стандартные процедуры.

HPLC для алкалоидов

HPLC позволяет разделять отдельные алкалоиды и их количественное определение. Для кратома стандартной целью является определение митрагинина и 7-гидроксимитрагинина; расширенные методы охватывают и пайнантеин, специогинин и специоцилиатин.

Детектор

• HPLC-DAD (diode array detector, UV-VIS) - более простой, более дешёвый, подходит для рутинного определения митрагинина (LOQ порядка 0,01 %).
• HPLC-MS/MS (тандемная масс-спектрометрия) - на порядки более чувствителен, идентификация на основе масс-спектра, подходит для следовых алкалоидов, включая 7-OH-MG (LOQ единицы нг/г).

Стационарная и подвижная фазы

Стандартно используется обращённая фаза (C18 колонка, 100-150 мм × 2,1-4,6 мм, частицы 1,7-3,5 μm). Подвижная фаза - градиент ацетонитрил/вода с добавлением муравьиной кислоты или аммоний-формиата для регулирования pH.

Подготовка образца

Стандартный порядок: навеска 0,1-0,5 г сушёного порошка, экстракция в метанол или смесь метанол/вода с помощью ультразвука, фильтрация (0,22 μm), ввод 1-10 μl. Для экстрактов разведение подстраивается под ожидаемое содержание.

ICP-MS для тяжёлых металлов

ICP-MS - референсный метод для определения следовых концентраций элементов. Принципом является ионизация образца в аргоновой плазме при ~7000 K и измерение ионов масс-спектрометром по отношению массы к заряду (m/z).

Подготовка образца

1. Навеска 0,2-0,5 г сухого вещества в тефлоновую ёмкость.
2. Микроволновое разложение в HNO₃ (6-8 мл) с H₂O₂ (1-2 мл) при температуре ~200 °C, давлении ~40 бар.
3. После остывания доведение деминерализованной водой до референсного объёма (обычно 25-50 мл).
4. Фильтрация или центрифугирование перед вводом в ICP-MS.

Внутренние стандарты

Для коррекции матричных эффектов добавляются внутренние стандарты - обычно ¹⁰³Rh, ¹¹⁵In, ²⁰⁹Bi в концентрации от единиц до десятков μg/л.

Измеряемые изотопы

Стандартно отслеживают ²⁰⁸Pb (свинец), ¹¹¹Cd (кадмий), ²⁰²Hg (ртуть), ⁷⁵As (мышьяк) и ⁶⁰Ni (никель). При необходимости добавляются другие (⁵²Cr, ¹²¹Sb, ¹³⁷Ba).

Limit of quantification (LOQ) и его значение

LOQ - наименьшая концентрация аналита, которую можно данной аналитической процедурой количественно определить с заданной точностью и правильностью (обычно относительное стандартное отклонение ≤ 10 %). У метода LOQ должен быть на порядки ниже действующего законодательного лимита - иначе метод не даёт надёжного оценивания.

Примеры типичных LOQ:

• HPLC-DAD для митрагинина: 0,01 % по массе (порядка 0,1 мг/г),
• HPLC-MS/MS для 7-OH-MG: единицы нг/г образца,
• ICP-MS для свинца: 0,005 мг/кг (то есть 0,005 μг/г) - на три порядка ниже законодательного лимита 3 мг/кг.

Сравнение с альтернативными методами

• GC-MS (газовая хроматография) для алкалоидов кратома менее подходит - молекулы термолабильны и потребовали бы дериватизации. Для следовых исследований используется, но не является стандартом.
• UV-VIS спектрофотометрия может дать суммарное содержание алкалоидов, но без разделения отдельных веществ. Для целей COA недостаточна.
• NMR позволяет структурную идентификацию, используется в исследованиях, но не для рутинного партионного контроля.
• AAS (атомно-абсорбционная спектрометрия) - более старый метод для тяжёлых металлов, сегодня в значительной степени заменён ICP-MS из-за более низкой чувствительности.

Часто задаваемые вопросы

Почему не GC-MS?

Алкалоиды кратома термически лабильны и в газовой хроматографии разлагались бы. Для надёжного определения используется HPLC.

Каков LOQ для митрагинина?

У HPLC-DAD порядка 0,01 % по массе, у HPLC-MS/MS единицы нг/г. Конкретное значение зависит от конкретного метода и прибора.

Можно ли измерить содержание дома?

Надёжно - нет. Количественные HPLC и ICP-MS требуют приборов стоимостью в сотни тысяч - миллионы крон, калибровки и метрологической прослеживаемости. Ориентировочные качественные тесты (например, цветные реакции на алкалоиды) имеют очень ограниченную доказательную ценность.

Достаточно ли одного метода для всего COA?

Нет. Комплексный COA требует комбинации методов: HPLC для алкалоидов, ICP-MS для металлов, LC-MS/MS для микотоксинов и культивационные методы для микробиологии. Аккредитованная лаборатория имеет их валидированные процедуры.

Источники

• Wang M. et al. (2014). High-performance liquid chromatographic analysis of mitragynine and 7-hydroxymitragynine. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 90, 32-39.
• USP <233>. Elemental Impurities - Procedures. United States Pharmacopeia.
• ČSN EN ISO/IEC 17025:2018. Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий.