HPLC та ICP-MS: лабораторні методи для аналізу кратому

Стисло

Два референсні методи для аналізу кратому в акредитованих лабораторіях - HPLC (високоефективна рідинна хроматографія) для визначення алкалоїдів і ICP-MS (мас-спектрометрія з індуктивно зв'язаною плазмою) для визначення важких металів. Обидва методи описані в USP і в стандартах ISO як стандартні процедури.

HPLC для алкалоїдів

HPLC дає змогу розділяти окремі алкалоїди та їх кількісне визначення. Для кратому стандартною метою є визначення мітрагініну і 7-гідроксимітрагініну; розширені методи охоплюють і пайнантеїн, специогінін і специоциліатин.

Детектор

• HPLC-DAD (diode array detector, UV-VIS) - простіший, дешевший, підходить для рутинного визначення мітрагініну (LOQ порядку 0,01 %).
• HPLC-MS/MS (тандемна мас-спектрометрія) - на порядки чутливіший, ідентифікація на основі мас-спектра, підходить для слідових алкалоїдів, включно з 7-OH-MG (LOQ одиниці нг/г).

Стаціонарна й рухома фази

Стандартно використовується обернена фаза (C18 колонка, 100-150 мм × 2,1-4,6 мм, частинки 1,7-3,5 μm). Рухома фаза - градієнт ацетонітрил/вода з додаванням мурашиної кислоти або амоній-форміату для регулювання pH.

Підготовка зразка

Стандартний порядок: наважка 0,1-0,5 г сушеного порошку, екстракція в метанол або суміш метанол/вода за допомогою ультразвуку, фільтрація (0,22 μm), уведення 1-10 μl. Для екстрактів розведення підлаштовується під очікуваний вміст.

ICP-MS для важких металів

ICP-MS - референсний метод для визначення слідових концентрацій елементів. Принципом є іонізація зразка в аргоновій плазмі за ~7000 K і вимірювання іонів мас-спектрометром за відношенням маси до заряду (m/z).

Підготовка зразка

1. Наважка 0,2-0,5 г сухої речовини в тефлонову ємність.
2. Мікрохвильове розкладання в HNO₃ (6-8 мл) з H₂O₂ (1-2 мл) за температури ~200 °C, тиску ~40 бар.
3. Після охолодження доведення демінералізованою водою до референсного об'єму (зазвичай 25-50 мл).
4. Фільтрація або центрифугування перед уведенням до ICP-MS.

Внутрішні стандарти

Для корекції матричних ефектів додаються внутрішні стандарти - зазвичай ¹⁰³Rh, ¹¹⁵In, ²⁰⁹Bi в концентрації від одиниць до десятків μg/л.

Вимірювані ізотопи

Стандартно відстежують ²⁰⁸Pb (свинець), ¹¹¹Cd (кадмій), ²⁰²Hg (ртуть), ⁷⁵As (миш'як) і ⁶⁰Ni (нікель). За потреби додаються інші (⁵²Cr, ¹²¹Sb, ¹³⁷Ba).

Limit of quantification (LOQ) і його значення

LOQ - найнижча концентрація аналіту, яку можна цією аналітичною процедурою кількісно визначити із заданою точністю й правильністю (зазвичай відносне стандартне відхилення ≤ 10 %). У методу LOQ має бути на порядки нижчим за чинний законодавчий ліміт - інакше метод не дає надійного оцінювання.

Приклади типових LOQ:

• HPLC-DAD для мітрагініну: 0,01 % за масою (порядку 0,1 мг/г),
• HPLC-MS/MS для 7-OH-MG: одиниці нг/г зразка,
• ICP-MS для свинцю: 0,005 мг/кг (тобто 0,005 μг/г) - на три порядки нижче законодавчого ліміту 3 мг/кг.

Порівняння з альтернативними методами

• GC-MS (газова хроматографія) для алкалоїдів кратому менш підходить - молекули термолабільні й потребували б дериватизації. Для слідових досліджень використовується, але не є стандартом.
• UV-VIS спектрофотометрія може дати сумарний вміст алкалоїдів, але без розділення окремих речовин. Для цілей COA недостатня.
• NMR дає змогу структурну ідентифікацію, використовується в дослідженнях, але не для рутинного партійного контролю.
• AAS (атомно-абсорбційна спектрометрія) - старіший метод для важких металів, сьогодні значною мірою замінений ICP-MS через нижчу чутливість.

Часті запитання

Чому не GC-MS?

Алкалоїди кратому термічно лабільні й у газовій хроматографії розкладалися б. Для надійного визначення використовується HPLC.

Який LOQ для мітрагініну?

У HPLC-DAD порядку 0,01 % за масою, у HPLC-MS/MS одиниці нг/г. Конкретне значення залежить від конкретного методу й приладу.

Чи можна виміряти вміст удома?

Надійно - ні. Кількісні HPLC та ICP-MS потребують приладів вартістю в сотні тисяч - мільйони крон, калібрування й метрологічної простежуваності. Орієнтовні якісні тести (наприклад, кольорові реакції на алкалоїди) мають дуже обмежену доказову цінність.

Чи достатньо одного методу для всього COA?

Ні. Комплексний COA потребує комбінації методів: HPLC для алкалоїдів, ICP-MS для металів, LC-MS/MS для мікотоксинів і культиваційні методи для мікробіології. Акредитована лабораторія має їхні валідовані процедури.

Джерела

• Wang M. et al. (2014). High-performance liquid chromatographic analysis of mitragynine and 7-hydroxymitragynine. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 90, 32-39.
• USP <233>. Elemental Impurities - Procedures. United States Pharmacopeia.
• ČSN EN ISO/IEC 17025:2018. Загальні вимоги до компетентності випробувальних і калібрувальних лабораторій.