HPLC a ICP-MS: laboratorní metody pro analýzu kratomu

Stručně

Dvě referenční metody pro analýzu kratomu v akreditovaných laboratořích jsou HPLC (vysoceúčinná kapalinová chromatografie) pro stanovení alkaloidů a ICP-MS (hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem) pro stanovení těžkých kovů. Obě metody jsou popsány v USP a v ISO normách jako standardní postupy.

HPLC pro alkaloidy

HPLC umožňuje separaci jednotlivých alkaloidů a jejich kvantifikaci. Pro kratom je standardním cílem stanovení mitragyninu a 7-hydroxymitragyninu; rozšířené metody pokrývají i paynantheine, speciogynin a speciociliatine.

Detektor

• HPLC-DAD (diode array detector, UV-VIS) - jednodušší, levnější, vhodné pro rutinní stanovení mitragyninu (LOQ řádově 0,01 %).
• HPLC-MS/MS (tandemová hmotnostní spektrometrie) - řádově citlivější, identifikace na základě hmotnostního spektra, vhodné pro stopové alkaloidy včetně 7-OH-MG (LOQ jednotky ng/g).

Stacionární a mobilní fáze

Standardně se používá reverzní fáze (C18 kolona, 100-150 mm × 2,1-4,6 mm, částice 1,7-3,5 μm). Mobilní fáze je gradient acetonitril/voda s přídavkem mravenčí kyseliny nebo amonium-formiátu pro úpravu pH.

Příprava vzorku

Standardní postup: navážka 0,1-0,5 g sušeného prášku, extrakce do methanolu nebo směsi methanol/voda za pomoci ultrazvuku, filtrace (0,22 μm), nástřik 1-10 μl. Pro extrakty se přizpůsobuje ředění podle očekávaného obsahu.

ICP-MS pro těžké kovy

ICP-MS je referenční metoda pro stanovení stopových koncentrací prvků. Principem je ionizace vzorku v argonovém plazmatu při ~7000 K a měření ionů hmotnostním spektrometrem podle poměru hmotnosti k náboji (m/z).

Příprava vzorku

1. Navážka 0,2-0,5 g sušiny do teflonové nádobky.
2. Mikrovlnný rozklad v HNO₃ (6-8 ml) s H₂O₂ (1-2 ml) při teplotě ~200 °C, tlaku ~40 bar.
3. Po vychladnutí doplnění demineralizovanou vodou na referenční objem (typicky 25-50 ml).
4. Filtrace nebo odstředění před nástřikem do ICP-MS.

Vnitřní standardy

Pro korekci matricových efektů se přidávají vnitřní standardy - typicky ¹⁰³Rh, ¹¹⁵In, ²⁰⁹Bi v koncentraci jednotky až desítky μg/l.

Měřené izotopy

Standardně se sleduje ²⁰⁸Pb (olovo), ¹¹¹Cd (kadmium), ²⁰²Hg (rtuť), ⁷⁵As (arsen) a ⁶⁰Ni (nikl). Při potřebě jsou doplněna další (⁵²Cr, ¹²¹Sb, ¹³⁷Ba).

Limit of quantification (LOQ) a jeho význam

LOQ je nejnižší koncentrace analytu, kterou lze daným analytickým postupem kvantifikovat s definovanou přesností a správností (typicky relativní směrodatná odchylka ≤ 10 %). U metody musí být LOQ řádově nižší než platný legislativní limit - jinak metoda neposkytuje spolehlivé hodnocení.

Příklady typických LOQ:

• HPLC-DAD pro mitragynin: 0,01 % hmotnostně (řádově 0,1 mg/g),
• HPLC-MS/MS pro 7-OH-MG: jednotky ng/g vzorku,
• ICP-MS pro olovo: 0,005 mg/kg (tedy 0,005 μg/g) - tři řády pod legislativním limitem 3 mg/kg.

Srovnání s alternativními metodami

• GC-MS (plynová chromatografie) je pro alkaloidy kratomu méně vhodná - molekuly jsou termolabilní a vyžadovaly by derivatizaci. Pro stopové studie se používá, ale není standardem.
• UV-VIS spektrofotometrie může poskytnout sumární obsah alkaloidů, ale bez separace jednotlivých látek. Pro účely COA není dostatečná.
• NMR umožňuje strukturní identifikaci, používá se ve výzkumu, ale ne pro rutinní šaržovou kontrolu.
• AAS (atomová absorpční spektrometrie) je starší metoda pro těžké kovy, dnes z velké části nahrazena ICP-MS kvůli nižší citlivosti.

Často kladené otázky

Proč ne GC-MS?

Alkaloidy kratomu jsou tepelně labilní a v plynové chromatografii by se rozkládaly. Pro spolehlivé stanovení se používá HPLC.

Jaký je LOQ pro mitragynin?

U HPLC-DAD řádově 0,01 % hmotnostně, u HPLC-MS/MS jednotky ng/g. Konkrétní hodnota záleží na konkrétní metodě a přístroji.

Lze měřit obsah doma?

Spolehlivě nikoliv. Kvantitativní HPLC a ICP-MS vyžadují přístroje za stovky tisíc až miliony korun, kalibraci a metrologickou návaznost. Orientační kvalitativní testy (např. barevné reakce na alkaloidy) mají velmi omezenou výpovědní hodnotu.

Stačí jediná metoda pro celé COA?

Ne. Komplexní COA vyžaduje kombinaci metod: HPLC pro alkaloidy, ICP-MS pro kovy, LC-MS/MS pro mykotoxiny a kultivační metody pro mikrobiologii. Akreditovaná laboratoř má jejich validované postupy.

Reference

• Wang M. et al. (2014). High-performance liquid chromatographic analysis of mitragynine and 7-hydroxymitragynine. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 90, 32-39.
• USP <233>. Elemental Impurities - Procedures. United States Pharmacopeia.
• ČSN EN ISO/IEC 17025:2018. Všeobecné požadavky na kompetenci zkušebních a kalibračních laboratoří.